NC克隆失败原因分析

失败类型

原因分析

解决方法

未获得克隆

1. 试剂问题^A：

感受态细胞失活（冻融降低感受态效率）；

载体降解。

2. 操作问题：

用错载体、用错抗生素

避免翻冰箱产生感受态冻融。

重新跑电泳鉴定载体浓度，OD值测浓度不一定准。

检查载体和操作。做阳性对照。

获得克隆但

没基因插入

或阳性率低

用载体引物PCR检测克隆有助于分析原因：

1. 载体引物检测有200 bp左右条带^B，是去

  除NC克隆框的载体自连导致。原因有：

片段含复杂结构；

片段加入量太少；

载体加入量太多；

反应体系没混匀。

2. 载体引物检测无带。原因有：

载体不对或用错载体；

杂菌污染；

回收片段有质粒模板污染。

片段扩增使用高保真酶、以质粒为模板、控制模板量和循环数^C。

参照试剂盒说明书的加入量^D；

片段：载体摩尔比大于1:1。

反应体系最后加入Nimble Mix，用移液器吸打10-20次充分混匀。

检查载体是否正确^E。

检查操作过程、培养基是否污染。

切胶回收、减少质粒模板量。